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      1. 北京物流信息聯盟

        血清抗體檢測方法﹑臨床應用分析及質量控制方法

        2022-08-23 07:16:30

        走過路過,不要錯過這個公眾號哦!

        摘要:

        目的 檢測人血清相關抗體,鑒別生物學假陽性或既往感染病例,提出判斷建議標準。

        方法? 用RPR法檢測非特異性抗體及滴度;用TPPA法,IgM-ELISA法檢測特異性抗體

        結果? 178例血清標本抗體RPR法陽性170人(95.5%),其中RPR滴度≤1:4者37人;滴度≥1:8者133人。TPPA法陽性者174人(97.75%);IgM-ELISA法陽性者162人(162/178 ,91.01%);在RPR滴度≦1:4時,TP-IgM-ELISA 法陽性者29人(6,23);在RPR滴度≥1:8時TP-IgM-ELISA 法陽性者133人(37,49,34,13)。

        結論? 我們建議初診(轉診)病人先檢測RPR抗體(含滴度)和TPPA抗體;如兩項為陰性,排除診斷;如TPPA法陽性,RPR滴度≥1:8且IgM-ELISA抗體陽性,病人有臨床癥狀,即可診斷為現癥病人。臨床治療4-6周后,只需復查RPR抗體和IgM-ELISA抗體是否轉陰及RPR滴度下降程度。


        關鍵詞 ???抗體 TPPA IgM-ELISA 生物學假陽性


        是由螺旋體感染而引起的一種性傳播疾病,其主要傳播方式為不潔性交,也可通過母嬰傳染,輸血等其他間接方式傳染。因此實驗室檢測螺旋體及患者血清中特異性抗體作為確認感染依據之一,并結合病史最終確診是否現癥感染或既往感染,是否需要治療,檢測的結果能否幫助臨床鑒別存在于老年人生物學假陽性和自身免疫性疾病引起生物學假陽性。


        檢測方法學可分為病原學和血清學兩類;病原學方法檢測:?為暗視野顯微鏡檢查法,或鍍銀染色法,以鏡下可找到螺旋體報告陽性結果;?分子生物學方法PCR法。血清學方法檢測:?抗類脂質抗原的非特異性反應素(主要是IgG和IgM),可用RPR,USR,TRUST和VDRL試驗檢測,用于篩查和療效觀察?螺旋體特異性抗體(主要是IgG和IgM),用ELISA,TPPA,FTA-ABS,WB等方法檢測,用于的確診試驗,不用于療效觀察。其中ELISA法可分別檢測單獨型別的IgG和IgM型抗體。


        通常我們認為病原體檢測即鏡下找到螺旋體是特異性好,準確性高的方法,但此方法一般需在硬下疳期的生殖器潰瘍部位組織液中找到,螺旋體入血后無法檢測。同時PCR方法雖敏感性高,由于受到實驗設備條件,技術經驗,患者就診時間及標本采集等因素影響,得到的陽性結果有時與臨床不相符,限制了在實驗室開展檢查,多用于感染研究。血清學方法ELISA,TPPA,FTA-ABS,WB等試驗,檢測血清混合抗體(IgM、IgG),目前以TPPA,WB及FTA-ABS為實驗室確診試驗。由于FTA-ABS和WB試驗需要熒光顯微鏡,高質量試劑及嚴格實驗室條件,不作為常規檢測試驗,多用于抗體研究檢測和疑難病例檢測。


        目前醫院系統用ELISA法或化學發光法(批量標本檢測),皮膚病性病防治機構以TPPA法(單人份或批量)試驗作為常規確診試驗。試驗陽性才能考慮是否感染。但特異性抗體中的IgG型抗體在治療后需要很長時間才能轉陰,部分人群甚至終生陽性,所以TPPA等試驗不能用于療效觀察。RPR等試驗可作為篩選試驗和用于療效觀察,非特異性抗體(非特異性反應素)在治療后幾周或數月可轉陰。而IgM型抗體是機體感染螺旋體后出現最早的抗體,一般在感染15天后可檢出,同時此抗體在規則治療后很快轉陰;IgM抗體可用于早期診斷及胎傳的診斷(IgM抗體不易通過胎盤屏障),也可作為治療療效觀察的新指標之一。

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        我們在臨床上經常遇到患者TPPA/ELISA法檢測特異性抗體陽性,RPR滴度從1:4~1:128不等;經規則治療3--6個月后,患者血清抗體復檢結果為RPR滴度下降了,但TPPA法或ELISA法試驗檢測的血清抗體仍是陽性,部分病人可能終身存在陽性?;颊哒J為治療無效,臨床醫生感到困惑,我們發現問題在于目前檢測試劑檢測的是螺旋體混合抗體,如果患者初診時以ELISA法,TPPA法,RPR法及滴度檢測抗體,同時增加TP-IgM抗體檢測(我們稱為初診檢驗模式);而治療后復診時檢測TP-IgM抗體以及RPR滴度,這時避免了ELISA法和TPPA法(檢測IgG型抗體)再次陽性結果的重復出現,這樣的檢驗報告結果有利于臨床觀察療效,同時與患者溝通容易一些(我們稱為復診檢驗模式)。


        ???? 我們用TPPA法,RPR及滴度試驗,ELISA-TP-IgM法檢測了2010年1月至2014年12月外院轉診及皮膚病門診178例患者血清抗體,按照初診檢驗模式和復診檢驗模式進行檢測,現報告如下。


        1 資料及方法


        1.1 資料 ? 178例老年人為2010年1月至2014年12月外院病人及本院皮膚病門診病人,其中男性94人,平均50.5歲;女性84人,平均47.3歲。20例正常人對照。


        1.2 試劑及儀器 ? RPR試劑由上??迫A生物工程公司生產;TPPA試劑由日本富士株式會社生產(珠海麗珠分裝);TP-IgM-ELISA試劑由德國歐蒙公司生產。RPR旋轉儀,南京華東電子集團公司生產;BD680型酶標儀美國公司生產;XB100型洗板機,北京宏潤達科技公司生產。


        1.3方法 ? 分別采集病人全血5ml,分離得到無溶血現象血清;RPR法,TPPA法和TP-IgM-ELISA法的操作嚴格按照試劑說明書進行。


        1.4 結果判斷:RPR法以出現凝集者為陽性,滴度試驗以血清最高稀釋倍數出現凝集報告稀釋倍數;TPPA法以未致敏顆??谉o凝集,致敏顆??壮霈F凝集為陽性。ELISA法用酶標儀在450nm波長讀取的吸光度值(OD);以血清標本OD/陰性對照OD≥2.1為標準,比值大于2.1者為抗體陽性。


        1.5 統計學處理?? 采用卡方檢驗,p<0.05為差異有統計學意義。


        2? 結果


        2.1 ? ?178例初診患者實驗室血清標本檢測結果

        ? ? ? ? ①RPR法陽性170人(170/178,95.5%),RPR陰性8人(4例老年人4例嬰幼兒);其中RPR滴度≤1:4者37(2,9,26;37/178;20.79%)人;滴度≥1:8 者133人(37,49,34,13;133/178,74.72%)。


        ? ? ? ? ②TPPA法陽性者174人(174/178,97.75%)。陰性者4人(4例老年人)。


        ? ? ? ? ?③TP-IgM-ELISA法陽性者162人(162/178 ,91.01%);在RPR滴度≦1:4時,TP-IgM-ELISA 法陽性者29人(6,23);在RPR滴度≥1:8時TP-IgM-ELISA 法陽性者133人(37,49,34,13)。


        ? ? ? ?④12(12/178)例老年患者中, 8例TPPA陽性,其中4例RPR陽性,RPR滴度≤1:4;4例RPR陰性;TP-IgM-ELISA試驗均陰性。4例TPPA法陰性,RPR陽性,RPR滴度≤1:4,TP-IgM-ELISA試驗均陰性 。????


        ? ? ? ? ⑤8(8/178)例嬰幼兒患者中4例RPR法,TPPA法,TP-IgM-ELISA法均陽性,RPR滴度≥1:8。4例僅TPPA法陽性;RPR法,TP-IgM-ELISA法陰性。


        ? ? ? ?⑥經治療6個月后,178例患者中失訪11人。167例成功復診患者中,RPR法陽性46人(46/167,27.54%),TPPA法167人陽性(167/167,100%),TP-IgM-ELISA法陽性者27人(27/167,16.17%)。

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        2.2 ? ?178例患者臨床診斷結果

        ???? ? ①TP-IgM-ELISA法陽性者162例(含嬰幼兒4人),結合TPPA,RPR滴度結果和臨床資料,診斷為現癥感染。


        ? ?②12例老年患者的TP-IgM-ELISA試驗均陰性,有8例TPPA法陽性,但RPR陰性或滴度≤1:4;另4例TPPA法陰性。結合臨床資料,12例均診斷為既往感染或生物學假陽性。


        ? ? ③8例嬰幼兒患者中4例RPR法,TPPA法,TP-IgM-ELISA法均陽性,RPR滴度≥1:8,最高到1:128,結合臨床資料及其父母血清抗體結果,1例診斷為現癥感染;3例為胎傳。另4例僅 TPPA法陽性;而RPR法,TP-IgM-ELISA法陰性,結合臨床資料排除。

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        2.3?? 178例標本 血清抗體陽性見表1

        2.4?? 167例(復診中失訪11人)治療6個月后復診病人血清抗體檢測陽性見表2

        2.5?? 8例嬰幼兒血清抗體檢測結果見表3

        2.6?? 檢測診斷建議標準見表4



        3討論

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        3.1? 根據傳染方式不同可分為獲得(后天)和胎傳(先天)。根據病程可分為早期(分為一期和二期)和晚期(又稱三期),此外還有潛伏(隱性)。早期傳染性大,破壞性小,經足量規則治療可治愈;晚期傳染性小,雖經治療只能減輕機體破壞程度而難以糾正器質性損害。螺旋體感染機體后免疫系統會產生兩類相關抗體:一類是抗類脂質抗原的非特異性反應素(主要是IgG和IgM)(又稱非特異性抗體)可用RPR,USR,TRUST和VDRL試驗檢測,作為篩選試驗和療效觀察,非特異性抗體在治療后幾周或數月可轉陰;另一類是特異性抗體(IgG,IgM),可用ELISA,TPPA,FTA-ABS,WB等方法檢測[1]。


        ? 3.2? 由于生物學假陽性的存在(部分老年人有基礎病或自身免疫性疾病產生自身抗體),我們觀察到12(12/178)例老年患者雖RPR試驗陽性,TPPA陽性,但IgM-ELISA試驗陰性,RPR滴度≤1:4,結合臨床資料病人否認有不潔性交史或輸血史等,均診斷為原因不明既往感染或生物學假陽性[2]。


        ? 3.3 TPPA/IgM-ELISA試驗均陽性的162例患者中,RPR滴度≥1:4,結合臨床資料后均診斷為現癥病人(一期或二期)。在經規則治療6個月后,167例復診患者(失訪11例)中,TPPA陽性患者167人;121例患者RPR試驗和140例患者IgM-ELISA抗體試驗由陽性轉為陰性。說明盡早檢測,規則治療,對于患者康復有指導意義。16例患者IgM-ELISA試驗仍為陽性,我們分析是否為療程不足或再感染原因引起不能排除,建議臨床進行第二次規則治療,同時待治療完成后行血清抗體的復檢。根據復檢結果并結合臨床癥狀判斷患者治療效果。由表2中RPR陽性人數及滴度分布情況看與初診比較均有下降;RPR仍為陽性的有46人,但RPR滴度較治療前明顯下降,此類患者仍需復診觀察一年以上,如隨訪中發現RPR滴度維持在1:4左右或以下,在排除再感染,神經,心血管等后,考慮為血清固定[3],一般不需再次治療。


        3.4? 8例嬰幼兒血清抗體結果見表3,由免疫學抗體產生的規律可知IgM型抗體是機體感染螺旋體后出現最早的抗體,IgM抗體不易通過胎盤屏障,一般在感染15天后可檢出,嬰幼兒血清抗體陽性表示有宮內感染。有4例嬰幼兒血清TPPA抗體陽性,RPR陽性且滴度≥1:8,TP-IgM抗體陽性,經結合其父母血清抗體結果及臨床資料,臨床診斷為胎傳3例和現癥1例(8歲女孩,經臨床資料分析考慮感染途徑為與其母密切接觸相關)。而IgG抗體可通過胎盤屏障進入嬰幼兒血液中,該類抗體轉陰的時間一般很長,因此我們觀察到另外4例嬰幼兒血清抗體僅TPPA抗體陽性,其他抗體試驗陰性,經結合其父母血清抗體結果,排除了。我們的檢測說明對于嬰幼兒血清抗體檢測及臨床解讀需謹慎,需結合其父母血清抗體情況來判斷。我們通過檢測TP-IgM抗體和RPR及滴度可排除大部分嬰幼兒診斷。這一點在其它醫院轉診到我院皮膚科門診后最終確診或排除的診斷情況來看,主要依靠實驗室檢測結果和臨床癥狀。


        3.5? 我們觀察到在成功復診的167例患者中TPPA仍為陽性與文獻報道的一致;我們的檢測結果表明IgM抗體轉陰的例數與初診的例數比較差異有統計學意義。TP-IgM抗體在治療后4周至8周即開始轉陰,是治療療效觀察的新指標之一,再結合RPR滴度下降的程度,能給臨床醫生診斷治療提供更加有效的血清學依據,與國內學者報道的相似[4]。


        ???? 3.6 我們在檢測診斷中體會到血清試驗項目名稱多,只有合理應用才能避免混淆。建議初診(轉診)病人先檢測RPR(含滴度)和TPPA法抗體。如果兩項為陰性,結合臨床資料可排除診斷。如果RPR和TPPA法抗體兩項陽性,但RPR滴度≤1:4,此時增加檢測IgM-ELISA抗體,如果為陰性,同時結合臨床資料,考慮為既往感染可能性大。如果IgM-ELISA抗體陽性且RPR滴度≥1:8,病人有臨床癥狀,即可診斷為現癥病人,具有傳染性。在臨床規則治療4到6個月后,只需復查RPR滴度和IgM-ELISA法IgM抗體是否轉陰并觀察RPR滴度下降程度來觀察評價療效;這樣就能避免實驗室檢驗結果與臨床醫生解釋不一致引起病人恐懼心理和抗生素濫用引起耐藥問題;尤其是老年人特異性抗體陽性結果時對檢驗結果的解釋需特別嚴謹,對老年人抗生素的使用要慎重[5]。


        ? 3.7 質量控制體會?? 我們在檢測工作中發現外院轉診患者抗體檢測方法多數是ELISA法,而我院使用TPPA法重新確認復查后,有時它們結果不一致,我們觀察到ELISA法抗體陽性例數多一些,分析認為是由于抗體試驗檢測方法原理不同而引起,尤其是ELISA法檢測結果處在灰區時報告弱陽性病人時,兩試驗結果差別更明顯;我們在多年的檢測實踐中體會到使用TPPA法的特異性優于ELISA法。我們知道ELISA法影響因素較多,有血清標本溶血,細菌污染,反復凍融等原因;也有試驗操作過程中出現的問題,加樣不準,溫育溫度時間過長過短,洗板不充分等;有學者認為與試劑包被的抗原(螺旋體)為基因表達產物有關,部分非螺旋體感染人體產生的抗體此試劑也可出現陽性結果。而TPPA法試劑中包含了可清除非特異性抗體組分,因此其檢測結果與FTA-ABS和WB試驗結果相關性高。同時試驗又不需特別昂貴的設備,判斷結果只需嚴格按照試劑盒提供的凝集圖譜,即可得到正確結果。該試驗在皮膚病防治機構使用相當普遍,適用于基層機構開展檢測與性病防治。同時我們檢測時高度關注試驗中可能出現的抗原抗體比例不合適引起的帶現象,一般可通過血清稀釋的辦法來避免。


        ?? 3.8質量控制體會?? TPPA法檢測抗體是在U型板上進行的凝集試驗,每個標本需4個U型孔,標本經稀釋后,在第3孔加非致敏顆粒(等同于試劑對照),第4孔加致敏顆粒(包被特異性蛋白),我的理解是每個標本都有試劑對照,可以排除血清中非螺旋體抗體的干擾或試劑保存不當等引起的檢測質量問題。判斷結果時應嚴格與試劑盒配置的陽性陰性標準凝集圖譜比對。在遇到致敏顆??着c非致敏顆??拙霈F凝集,此時必須用試劑中的干粉溶解稀釋液按說明書將血清標本進行吸附操作后,重新檢測,最終得出正確結果。當檢測結果處在灰區時如何報告?我們的處理方法是聯系臨床醫生,了解病人的病史后可報告為陰性,并建議病人隨診復查,如果復檢時發現抗體有陽性進展,盡快報告臨床醫生。


        ??? 3.9質量控制體會?? TP-ELISA-IgM試驗方法雖屬于酶聯法,但與常規ELISA的檢測不同之處是檢測時首先 第一步將血清與專用吸附劑試劑按1:10的比例室溫中反應10分鐘后,3000轉/分離心5分鐘,使得血清中IgG類抗體及其它非特異性抗體產生沉淀,檢測時吸取上清液,這樣處理后IgM抗體檢測的特異性進一步提高了。


        ?3.10 學習臨床知識體會 ?通過與臨床醫生的溝通,我認為檢驗技師掌握臨床常識對檢驗結果的合理解釋有幫助。對于存在的生物學假陰性和假陽性問題,如病人患有自身免疫病,腫瘤,糖尿病,及病毒感染者,結核病,麻風病等慢性感染性疾病均有可能導致檢測假陽性,尤其是孕婦和老年人;這類病人血清出現的假陽性結果以RPR法陽性多見,其滴度不高,常在1:4--1:8之間,但特異性抗體試驗陰性。終上所述RPR法的陽性反應并非特有;TPPA法或ELISA法的陽性反應,僅表示檢測到了患者血清存在抗體,是否為病人必須結合臨床資料綜合判斷。TP-IgM抗體檢測對某些特殊人群診斷有重要鑒別作用,可作為臨床診斷,評價治療療效,觀察再感染的新指標之一。

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        參考文獻

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        ?

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        3.李保強,朱彥明,陸潔.血清學假陽性疾病分析及與的對比【J】.中國皮膚? 性病學雜志,2013,23(5):298-299【J】

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        ?4.曾霓,曹碧蘭.血清學檢測方法研究和應用進展【J】.中國皮膚性病學雜志,2014(5):530-533

        5.郭偉,孫靜.老年人抗螺旋體抗體陽性的臨床分析及防治對策【J】.檢驗醫學與臨床,2013 ,10(5):349-350

        ?

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        作者:呂新民 主任技師210042 南京市職業病防治院皮膚病防治所檢驗科

        ????? 江蘇大學醫學院醫學檢驗本科畢業,主要從事免疫學檢測。

        ????? Tel:13601469499







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