上海市臨床檢驗中心? 馮仁豐
摘要：糖化血紅蛋白A1c（HbA1c）是診斷糖尿病和監測其治療效果的重要指標。在國際臨床化學與檢驗醫學聯合會（IFCC）定義了HbA1c的被測量之后，經過各方的努力，全球各臨床實驗室HbA1c檢測結果間的差異正逐步減小。所有提供HbA1c檢測產品的廠商都不會客觀地描述自己產品的弱點，只會強調其優點和臨床價值。面對HbA1c檢測的現狀，臨床實驗室必須充分了解每個產品的特性及其不足之處，在將產品用于臨床檢測前必須驗證產品的分析性能。只有確認其分析性能能夠用于臨床檢測時，才能使用。一個實驗室內必須具備2種不同檢測方法的產品，這樣才能識別患者樣品內有無異常血紅蛋白。目前，盡管人們認為免疫學方法檢測HbA1c時無異常血紅蛋白的干擾，但國際上尚未從臨床上對各種異常血紅蛋白的影響作出客觀的判斷。為了患者的利益，臨床實驗室一定要充分了解更多的信息。
關鍵詞：糖化血紅蛋白；標準化；準確度
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（上接本刊2016年第5期）
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六、HbA1c檢測準確度的現狀
1968年，RAHBAR等[1-2]首次發現糖尿病患者HbA1c升高。40余年以后，HbA1c已成為糖尿病診斷和治療一個不可或缺的指標。自從DCCT、UKPDS等臨床試驗開展以來，HbA1c檢測的標準化工作獲得了相當大的進展，明確了糖尿病患者血糖控制（由HbA1c檢測確定）與其并發癥之間的關系[3]。
由于HbA1c檢測方法的發展，各大廠商在其產品特點和檢測準確度宣傳上有很多針對異常血紅蛋白影響HbA1c檢測結果的介紹。尤其是我國，在廠商刻意夸大宣傳的情況下，臨床實驗室對其產品優點和缺點的了解很模糊。其實，任何一個檢測方法都有其特點和優點，也一定有不足之處。
????????（一）血紅蛋白病
血紅蛋白病是由于血紅蛋白分子結構異常（異常血紅蛋白?。┗蛑榈鞍纂逆満铣伤俾十惓＃ㄖ榈鞍咨烧系K性貧血，又稱地中海貧血）所引起的一組遺傳性血液病。
1.血紅蛋白血紅蛋白是一種結合蛋白，相對分子質量為64000，由珠蛋白和血紅素構成。血紅素由原卟啉和亞鐵原子組成。1個珠蛋白分子有2對肽鏈。一對是α鏈，由141個氨基酸殘基構成，在氧運輸中具有重要的生理作用；另一對是非α鏈，有β、γ、δ、ξ（結構與α鏈相似）及ε鏈5種。1條肽鏈與1個血紅素連接，構成1個血紅蛋白單體。人類血紅蛋白是由2對（4條）血紅蛋白單體聚合而成的四聚體。不同類型的血紅蛋白其珠蛋白結構略有不同，但血紅素均相同。
2.正常人出生后的3種血紅蛋白正常人出生后有3種血紅蛋白：（1）HbA。由1對α鏈和1對β鏈組成，即α2β2，是正常人主要的血紅蛋白，占血紅蛋白總量的95%以上。在胚胎2個月時HbA即有少量出現，出生時HbA占血紅蛋白總量的10%～40%，出生6個月后即達成人水平。（2）HbA2。由1對α鏈和1對δ鏈組成，即α2δ2，出生后6～12個月起產生，占血紅蛋白總量的2%～3%。（3）HbF。由1對α鏈和1對γ鏈組成，即α2γ2，出生時占體內血紅蛋白總量的70%～90%，之后逐漸減少，至出生后6個月，其濃度降至血紅蛋白總量的1%左右。
3.血紅蛋白的基因血紅蛋白不同的肽鏈由不同的遺傳基因控制。珠蛋白基因突變使肽鏈的單個或多個氨基酸替代或缺如，導致珠蛋白分子結構改變，稱為異常血紅蛋白（或血紅蛋白變異體）。全世界范圍內經結構分析證實的異常血紅蛋白日益增多，至20世紀90年代初期已達600多種，但僅不到1/3的異常血紅蛋白會出現臨床癥狀。據世界衛生組織估計，全球約有1.5億人攜帶血紅蛋白病基因，因此，已將血紅蛋白病列為嚴重危害人類健康的6種常見病之一。我國云南、貴州、廣西、新疆等地異常血紅蛋白病發病率較高，現已發現異常血紅蛋白67種，包括α鏈（34種）、β鏈（26種）、γ鏈
（4種）等異常，其中19種為我國首次發現。地中海貧血多發于我國華南及西南地區。根據近10年來我國28個地區近100萬人口的普查資料，異常血紅蛋白病的發病率為0.33%，α-地中海貧血的發病率為2.64%，β-地中海貧血的發病率為
0.66%。
4.異常血紅蛋白對HbA1c檢測的影響血紅蛋白中HbA約占98%，HbA1c也在HbA中，而其他正常血紅蛋白中沒有能被糖化的β鏈。如果糖尿病患者合并血紅蛋白病，其產生的各種異常血紅蛋白會被糖化，影響HbA1c的檢測，其異常的蛋白結構也會對HbA1c的檢測造成影響。
????????（二）NGSP標準化和IFCC標準化
如前所述，ADA為了確定控制糖尿病患者的血糖是否可以減少糖尿病并發癥的發生，在當時缺乏HbA1c參考物質和參考方法的情況下，采取了標準化措施，得到了全世界第1個糖尿病方面的結論，即對糖尿病的控制可以減少或減緩糖尿病并發癥的發生。美國為了將研究成果在美國國內和全世界范圍內應用，實施并推廣了NGSP，使全世界的HbA1c檢測結果統一以百分值（%）表示。NGSP采用HPLC層析技術分離HbA1c，但現已被證實其分離的HbA1c不是單一蛋白。而IFCC既有參考物質，又有參考方法，對HbA1c的標準化非常完整。因此，ADA認定IFCC的HbA1c參考系統為全球唯一的參考系統，并且承認美國的NGSP結果可上溯至IFCC的參考物質和參考方法。這在以往任何領域都從未有過。但不可否認的是美國NGSP對全世界HbA1c檢測的影響很大，伯樂（Bio-Rad）等專注于HPLC離子交換技術的公司多年來在HPLC技術上有了很大的改進。IFCC實施的HbA1c標準化盡管晚了幾年，但IFCC對HbA1c標準化的貢獻是前人在這個領域從未有過的。為了使IFCC的成果盡快在臨床上得到應用，各大廠商已經開發出免疫學方法和酶法產品用于臨床實驗室檢測HbA1c。這些方法可以直接報告IFCC結果。由于支持IFCC開展參考方法和參考物質研究并形成相應檢測方法的廠商幾乎是同一家，所以其在推廣免疫學方法的產品時，強調免疫學方法的HbA1c結果可直接溯源至IFCC參考系統，而且不受任何異常血紅蛋白的影響；同時指出HPLC無法避免異常血紅蛋白的干擾。
在國內市場上，報告NGSP結果的產品廠商和報告IFCC結果的產品廠商競爭非常激烈。尤其是檢測方法能否特異地消除異常血紅蛋白干擾是各大廠商競爭的重點。盡管國際上認為NGSP和IFCC結果均有效，但這已影響到臨床實驗室對HbA1c結果的解釋。
（三）對HbA1c常規檢測方法的分析
1.以往HbA1c檢測出現差異的原因在IFCC對HbA1c的被測量進行定義前，任何血紅蛋白被糖化的形式都是糖化血紅蛋白的1個組分，導致糖化血紅蛋白在定量檢測上非?；靵y。以正常的血紅蛋白為例，在血紅蛋白上有多個游離氨基，這些游離氨基均可被葡萄糖糖化，而且在糖化過程中，游離氨基是被隨機糖化的，糖化可發生在血紅蛋白β鏈N端的第1個氨基酸[纈氨酸（β-N-Val-1）]，也可以在β鏈第17個、第20個和第66個賴氨酸（β-Lys-17、β-Lys-20、β-Lys-66）的ε氨基，又或在α鏈N端的第1個氨基酸[纈氨酸（1α-N-Val-1）]、α鏈第7個和第16個賴氨酸的ε氨基上。在上述7個可以被葡萄糖糖化的位點上，被糖化的任意一個位點或各個糖化位點的任意組合是導致各種檢測方法出現差異的原因。另外，異常血紅蛋白上還有其他可糖化的位點。
2.IFCC的HbA1c定義為了使糖化血紅蛋白檢測標準化，IFCC對糖化血紅蛋白進行了定義：β鏈N端的纈氨酸被糖化的血紅蛋白稱為糖化血紅蛋白（即HbA1c）。β鏈上其他位點以及α鏈上的位點被糖化的血紅蛋白均不認可為糖化血紅蛋白。IFCC在充分考慮了糖化血紅蛋白分子結構復雜性的基礎上第1次明確了HbA1c的定義。只有硬性規定了某個分子結構為“HbA1c”，才能使HbA1c的檢測結果在全球具有可比性。但不能否認的是沒有被IFCC定義的糖化血紅蛋白是客觀存在的。HbA1c在檢測量值上實現了全球的可比性，卻使臨床遺漏了已經發病的糖尿病患者血液中其他分子結構的糖化血紅蛋白。因此，在糖尿病患者診斷和療效監測中，采用免疫學方法檢測HbA1c出現了明顯的臨床問題[4]。
????3.HbA1c的常規檢測方法（免疫學方法和酶法）由于常規檢測方法的限制，IFCC參考方法將未糖化的血紅蛋白定義為N端纈氨酸未被糖化的β鏈血紅蛋白。但在常規檢測中，一般方法難以分離出未被糖化的β鏈血紅蛋白。因此，臨床實驗室還是沿用了傳統的檢測血紅蛋白的方法，以比色法檢測樣品中的血紅蛋白，以“紅色”程度來表示血紅蛋白總量。這個方法檢測出的是樣品中所有含有高價鐵離子的血紅蛋白，除包括正常的α、β、γ、δ、ξ及ε鏈之外，還有各種異常血紅蛋白中的各種鏈。這與IFCC對HbA1c定義中未糖化血紅蛋白僅僅是β鏈血紅蛋白的要求完全不同。因此，HbA1c計算公式中的分母在無形中被放大了。如果免疫學方法使用的抗體完全符合IFCC對HbA1c的定義，那么最后得到的HbA1c結果會偏低。因此，在HbA1c免疫學檢測方法開始應用時，有學者認為檢測方法受到了干擾[5]。RHEA等[5]介紹了識別HbAβ鏈N端糖化氨基酸結構的HbA1c免疫學定量檢測方法。他們在文章中寫到：第1代免疫學檢測試劑中的抗體針對的抗原決定簇主要分布在血紅蛋白β鏈的第4～10個氨基酸，包含了第6個可被改變并形成異常血紅蛋白[血紅蛋白S（HbS）和血紅蛋白C（HbC）]的氨基酸位置。正是因這些異常血紅蛋白的存在，HbA1c檢測受到了干擾，這也促進了第2代免疫學檢測試劑的發展。第2代試劑使用的抗體包含了血紅蛋白β鏈第1～4個氨基酸，因此極大地消除了來自HbS和HbC的干擾，與第1代檢測試劑相比，其準確度明顯被改善。第2代免疫學檢測試劑的抗體通過結合類似于HbA的HbS和HbC，為具有雜合子的患者提供了臨床上有用的HbA1c檢測值，而他們的RBC壽命基本上是正常的。這篇文章的解釋讓人疑惑。使用了與IFCC參考方法中檢測β鏈N端的六肽對應的抗體，檢測的是第4～10個氨基酸的多肽鏈，應與IFCC參考方法一致，為什么會出現“干擾”？原因在于IFCC充分考慮到異常血紅蛋白在蛋白結構上的突變多發生于HbAβ鏈N端起的第6個氨基酸，因此其HbA1c參考方法只檢測β鏈N端起的六肽。正常的HbAβ鏈N端的6個氨基酸序列為Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-，HbSβ鏈N端的6個氨基酸序列為Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-，HbCβ鏈N端的6個氨基酸序列為Val-His-Leu-Thr-Pro-Lys-?；ハ啾容^可發現，HbA、HbS和HbC的第6個氨基酸不同。IFCC的專家非常注重此點，只切下了6個氨基酸多肽進行分析，消除了HbS和HbC對檢測的干擾。經典的免疫學方法也遵循了這個特點，避免了HbS和HbC的干擾。但是，HbA1c計算公式中的分母采用了傳統檢測方法得到的血紅蛋白值。由于傳統檢測方法測定了所有類型的血紅蛋白，違背了IFCC對HbA1c的定義，因此分母的數字被放大，導致最后計算得到的HbA1c值縮小了，所以這個結果被說成是“受到了干擾”。而第2代免疫學檢測試劑使用的抗體只針對β鏈N端第1～4個氨基酸的四肽。這樣就回避了IFCC對β鏈N端第6個氨基酸為谷氨酸的要求。無論是哪種血紅蛋白，只要具有類似HbAβ鏈N端的4個氨基酸，都能被檢測出來。這樣就放大了HbA1c計算公式中的分子。巧合的是HbA1c計算公式中的分母因檢測了所有非糖化血紅蛋白而放大，分子也因檢測了各種類似的糖化血紅蛋白而放大，二者放大后的數值相除，得到了與IFCC參考方法檢測結果非常相似的數值。這樣的巧合在某公司的資料上非常明確，其HbA1c計算公式為HbA1c=（HbA1c+HbX1c）/（總血紅蛋白+HbX）。式中的分母是“總血紅蛋白+HbX”，“HbX”為異常血紅蛋白；分子是“HbA1c+HbX1c”，HbX1c是所有異常血紅蛋白被糖化的部分。因此，HbA1c的免疫學檢測方法在檢測量值上可以溯源至IFCC的參考系統。但在實際檢測中，不受任何異常血紅蛋白影響的情況是不存在的。HbA1c酶法基本原理是首先由蛋白酶從血紅蛋白β鏈N端處切下2個氨基酸的雙肽，然后在幾個酶的作用下水解，最后顯色檢測。酶法比免疫學方法更簡練，只用2個氨基酸的小肽。酶法不需要考慮各種異常血紅蛋白的結構，只要β鏈N端最后1個氨基酸為纈氨酸，不管是哪種異常血紅蛋白，酶法均將其列為檢測對象。因此，異常血紅蛋白對酶法的影響很大。
????????（四）臨床實驗室HbA1c檢測現狀
????從RAHBAR等[1-2]在電泳圖譜上發現糖尿病患者有異常的血紅蛋白起，無論是DCCT還是IFCC，均利用分離圖譜對HbA1c進行定量檢測。DCCT的實驗室在層析分離圖譜上觀察到HbA1c峰，并結合未糖化的血紅蛋白峰（同時加上HbA1c峰）計算出HbA1c的百分值。IFCC的HbA1c工作組提出的參考方法采用HPLC技術分離HbA1c和HbA0六肽，然后再進行定量檢測。他們使用的也是HPLC的分離圖譜。因此，臨床實驗室在檢測糖尿病患者HbA1c時如果僅僅使用免疫學方法或酶法在自動化儀器上進行檢測，雖然速度更快、成本更低，但HbA1c結果只有一個檢測值，根本無法了解患者究竟有無異常血紅蛋白。有學者借用SACKS等[4]的研究成果，認為：通過HPLC的分離圖譜就可以看出HPLC分離方法的落后，有很多異常血紅蛋白的分離峰掩蓋了HbA1c的峰，因此HPLC根本無法消除所有異常血紅蛋白對HbA1c檢測的影響。從這篇文章可以看出我們的檢驗界同道并沒有認真閱讀Sacks的文章。
????Sacks博士是著名的糖尿病專家，是他和其他DCCT專家共同完成了DCCT這項臨床試驗，得出了控制血糖與糖尿病并發癥之間的關系。他們正是使用離子交換HPLC，采取強制標準化措施，得到了這個偉大的結論。NGSP參考實驗室至今依然使用離子交換HPLC檢測HbA1c。盡管NGSP將離子交換HPLC列為參考方法，但這些頂級專家早在21世紀初就已經以綜述的形式告誡所有實驗室：必須謹慎使用離子交換HPLC，千萬不要將HPLC自動報告的結果直接發給臨床，因為極有可能會因患者的異常血紅蛋白掩蓋了HbA1c而導致檢測結果出現錯誤。必須先看HPLC的層析圖，然后再考慮如何發出檢測報告。如今，面對免疫學檢測方法的強大優勢，ADA的專家們很快接受了不受異常血紅蛋白影響的免疫學檢測產品[Tina-quantHbA1c產品（羅氏公司）]。尤其是在近2年的研究中，為了解異常血紅蛋白對各種檢測方法的影響，均將免疫學檢測方法和硼酸親和方法列為比較方法，這也充分顯示了ADA明確的觀點。
時至今日，很多臨床實驗室依然將離子交換HPLC作為檢測HbA1c的首選。原因在于HPLC為每個患者樣品提供了一張便于判斷和使用的層析圖。盡管免疫學檢測方法在很多研究中被認為很少受到異常血紅蛋白的干擾，但如果僅僅是一個檢測數據，根本無法讓實驗室知道檢測的樣品中有無異常血紅蛋白。
復旦大學附屬中山醫院檢驗科的做法非常值得學習。無論是為一致性計劃的調查品定值，還是常規檢測患者樣品的HbA1c，他們均先使用離子交換HPLC進行檢測，從層析圖上先作出判斷。一旦層析圖顯示HbA1c難以區分時，他們再采用免疫學方法檢測，同時檢測糖化白蛋白，結合糖化白蛋白結果和患者近期的血糖表現對患者的血糖狀況和HbA1c結果作出判斷。
羅氏公司cobas系列檢測系統的HbA1c產品說明書寫得非常好，其中寫到：由于檢測原理的問題，必須要謹慎解釋各種異常血紅蛋白值下患者的任何HbA1c結果。異常血紅蛋白會影響紅細胞的半衰期或體內糖化作用速度。在這些情況下，即便是分析上正確的結果也不能反映正常血紅蛋白患者可預期的血糖控制水平。只要懷疑存在異常血紅蛋白（如HbSS、HbCC或HbSC）影響HbA1c值和血糖控制之間的相關性，就不得使用HbA1c值來診斷糖尿病。
盡管大家都認為免疫學方法很少受異常血紅蛋白的干擾，但ADA的導則明確指出：只要患者樣品中具有異常血紅蛋白，其HbA1c結果就不可隨意報告給臨床，不能作為糖尿病的診斷依據。由此可見，僅憑一個HbA1c檢測值是不能看出患者樣品中有異常血紅蛋白的。因此，復旦大學附屬中山醫院的做法值得推廣，他們的做法完全符合ADA導則的精神。建議臨床實驗室首先使用離子交換HPLC檢測，發現問題后再采用免疫學方法進行檢測。
在我國，越是南方地區，異常血紅蛋白對糖尿病診斷的影響就越嚴重。目前，我國南方地區的人群不斷流入全國各地，同時各地也出現了越來越多新的糖尿病患者，因此各地臨床實驗室應時刻注意異常血紅蛋白對HbA1c檢測結果的影響。
無論臨床實驗室采用什么方法檢測HbA1c，均應認真了解異常血紅蛋白對HbA1c檢測結果的影響。尤其是在選擇HbA1c檢測產品時，一定要仔細閱讀廠商提供的說明書，詳細了解其分析性能。使用免疫學方法或酶法檢測HbA1c的臨床實驗室最好另外再準備類似離子交換HPLC的產品，用于檢測樣品中有無異常血紅蛋白。對于正在使用離子交換HPLC的臨床實驗室，應備有免疫學方法或酶法的產品。一旦在HPLC層析圖上發現并確定為異常血紅蛋白時，應使用其他方法進行比較，并及時與臨床聯系，檢查患者的糖化白蛋白、近期使用血糖儀自我監測的資料和臨床表現等，防止發出錯誤報告。
我國各地經濟發展水平差異較大，一些經濟欠發達的地區特別要注意患者營養不良、近期有出血或輸血等情況，這些情況均會影響紅細胞的壽命。對于這樣的患者不應將HbA1c作為糖尿病診斷或治療監測的指標，應采用糖化白蛋白、果糖胺以及直接葡萄糖檢測等項目代替，以免作出錯誤診斷，延誤治療[4]。
七、總結
HbA1c是診斷和監測糖尿病治療效果的重要指標。經過IFCC的努力，全球HbA1c檢測結果的差異正逐步縮小。
所有提供HbA1c檢測產品的廠商都不會客觀地描述自己產品的缺點，只會強調其優點和臨床價值。為了患者的利益，每個實驗室必須完善檢測質量管理。在將HbA1c檢測產品用于臨床檢測前必須驗證其分析性能。只有確認產品的分析性能能夠用于臨床檢測時，才能使用。但我國的臨床實驗室在這方面至今做得很差，應引起各實驗室的重視。
一個實驗室內必須具備2種不同檢測方法的產品，才能識別患者樣品內有無異常血紅蛋白。目前，盡管人們認為免疫學方法檢測HbA1c時無異常血紅蛋白的干擾，但國際上尚未從臨床上對各種異常血紅蛋白的影響作出客觀的判斷。為了患者的利益，臨床實驗室一定要充分了解更多的信息。大家還需要認真學習！
參考文獻
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(本文轉自檢驗醫學2016年6月第31卷第6期)
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