輕松七步掌控免疫熒光
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作者：中子
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免疫熒光技術（Immunofluorescence technique ）又稱熒光抗體技術，它是標記免疫技術中發展最早的，在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術，對抗原進行細胞定性和定位分析。Coons等于1941年首次采用熒光素進行標記而獲得成功。自此該技術在科研領域發光發熱啦！
免疫熒光主要有如圖兩種檢測方法：
新手在開始免疫熒光實驗的時候，經常被例如細胞鋪板密度、細胞固定以及如何確?？贵w特異性等問題困擾，以下是中子幾年實驗下來的一些小小建議，希望可以幫助小伙伴們獲得更好的實驗結果：
1、 對于細胞爬片的免疫熒光選擇合適的細胞種板密度
細胞數過多時，生長過密，細胞結構不清，易導致染色背景深，細胞數過少時，會使貼壁貼壁不佳，狀態不好，一般以六孔板為例，（1-5）×100000比較適宜。
2、細胞更好地固定
為達到最佳檢測效果，細胞需要經過固定和通透，此步驟很重要，現在固定液選擇比較多，有4%多聚甲醛、甲醇、乙醇、丙酮以及丙酮和甲醇混合液（1：1），但效果最好的應用最多的還是推薦4%多聚甲醛。
3、優化封閉液
為防止內源性非特異性蛋白抗原的結合，需要在一抗孵育前先用血清（與二抗來源一致 如 一抗為兔抗，二抗為山羊抗兔，那么封閉液就用山羊血清）封閉，減弱背景著色。
血清封閉的時間是可以調整的，一般為30min。
4、抗體的特異性，設立對照組
這個關系到結果的準確性，一定要選擇特異性強的抗體，這樣可以避免高背景和不理想的蛋白定位，并且選擇合適的抗體稀釋比例，一般1：20-100 之間比較合適，但還是要自行摸索最佳梯度，建立最好的稀釋比例，抗體濃度過低，會導致產生的熒光過弱，影響結果的觀察噢！加入熒光抗體后一定要記得避光?。?！每次試驗時 ，建議設置以下三種對照：
① 陽性對照：陽性血清+熒光標記物
② 陰性對照：陰性血清+熒光標記物
③ 熒光標記物對照：PBS+熒光標記物
5、洗滌也要重視
為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當地加強清洗（延長時間和增多次數）尤為重要，一般在一抗的清洗是5min*3次；
注意：
（1）單獨沖洗，防止交叉反應造成污染。
（2）溫柔沖洗，防止切片的脫落；
（3）沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結合的物質。
（4）PBS的PH和離子強度的使用和要求，建議PH在7.4-7.6濃度是0.01M。（中性及弱鹼性條件（PH7-8）有利于免疫復合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強度有利于免疫復合物的形成，而高離子強度則有利于分解）
6、復染和封片是最后收尾工作
復染的目的是形成細胞輪廓，從而更好地對目標蛋白進行定位（一般常用DAPI復染）。而為了長期保存，我們一般用緩沖甘油等封片，此外還有專門的抗熒光萃滅封片液（如博士德等公司）；同時還要注意避免產生氣泡。
7、見證“奇跡“的時刻——熒光顯微鏡下觀察實驗結果
熒光染色后一般在1h內完成觀察，或于4℃保存4h，一般標本在高壓燈下照射超過 3min，就有熒光減弱現象，經熒光染色的標本最好在當天觀察，隨著時間的延長，熒光強度會逐漸下降。
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解螺旋.科研公益講座系列.RNA-seq(上海)
RNA-seq是一種定量分析轉錄組的高通量測序技術，相比于傳統的芯片技術，精度更高，應用更廣泛?？捎糜谟^察疾病發生過程中病灶部位內部的基因表達水平變化、預測腫瘤中潛在的融合基因、研究已知lncRNA的表達、預測新的lncRNA、進行新物種的轉錄組數據構建和功能研究等方面。
在經歷不到10年的發展歷程后，RNA-seq技術已成為一種常規的高通量實驗技術，并且已經成為轉錄組分析的主要工具。如此高大上的技術，其實你也可以擁有。5月14日就讓我們在解螺旋兩位大V專家的指引下，一起加入轉錄組研究的神秘旅程！
講座內容包括：
轉錄組研究歷史和現狀
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轉錄組研究基本思路
轉錄組數據的比對
表達量估計和分析
差異表達與功能分析
主講人：
解螺旋大V專家：黃老師、張老師，多年從事高通量測序數據分析與相關流程構建工作，在轉錄組、lncRNA和單細胞測序等方面積累了豐富的經驗，工作成果已發表在 Cell、Cell StemCell、 BMC Genomics等雜志。
地點：上海師范大學桂林路64號1號樓107室
時間：2015年5月14日（周四）晚6點-8點
上海地區有興趣參加的朋友請掃碼入群報名
Meta分析培訓班武漢站（2015/5/16-2015/5/17）
課程介紹：本次培訓內容圍繞系統評價的制作流程進行設計，包括循證醫學、系統評價/Meta分析概述；臨床研究問題的構建；Meta分析中的統計學問題；循證醫學文獻檢索策略與方法；常見的臨床研究報告的質量評價；全面掌握干預性、診斷性、病因、預后等系統評價/Meta 分析的制作方法；掌握Revman5.3 軟件Stata13.0軟件等軟件在Meta 分析中的應用，最終具備獨立制作系統評價解決問題的能力。
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有興趣的朋友請點擊本文左下角“閱讀原文”或咨詢：
固話：021-64173538-800（工作日：8:30-17:00）
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13661429647（張老師）
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